《博物馆奇妙夜2》延续了前作的奇幻设定，讲述了保安拉里·戴利（本·斯蒂勒饰）在博物馆文物因“复活黄金碑”失效而失去生命力后，前往史密森尼博物馆展开冒险的故事。影片以拉里发现博物馆展品“死气沉沉”为开端，通过他与法老阿卡曼拉（汉克·阿扎利亚饰）的对话，引出黄金碑被送往华盛顿史密森尼博物馆修复的情节。拉里为拯救老朋友们，深夜潜入史密森尼，却意外卷入一场跨越时空的混乱——这里收藏的歷史人物与怪物同样因黄金碑的力量复活，包括暴君卡哈蒙拉（同由汉克·阿扎利亚饰）、拿破仑（阿兰·夏巴饰）等反派角色，而拉里必须联合罗斯福总统（罗宾·威廉姆斯饰）等旧友，对抗邪恶势力并找回黄金碑。
人物关系错综复杂却脉络清晰：拉里作为核心人物，与史密森尼博物馆的飞行员艾米莉亚·埃尔哈特（艾米·亚当斯饰）形成新搭档，两人在冒险中发展出微妙情感；反派卡哈蒙拉与拿破仑结成联盟，企图利用黄金碑统治世界，而拿破仑的傲慢与卡哈蒙拉的残暴形成鲜明对比；罗斯福总统继续担任拉里的精神导师，其蜡像与史密森尼的阿尔伯特·爱因斯坦（尤金·列维饰）模型产生趣味互动。此外，前作中的小猴子德克斯特、匈奴王阿提拉等角色回归，与史密森尼的巨型章鱼、林肯雕像等新角色碰撞出喜剧火花。影片通过“复活文物”的设定，将歷史人物与现代价值观巧妙嫁接，如拿破仑沉迷于社交媒体、林肯雕像化身行动派英雄，既强化了喜剧效果，也暗喻了歷史与当代的对话。
剧情高潮集中在拉里团队与反派争夺黄金碑的博物馆大战：拉里利用对歷史知识的了解，联合各时代人物设计陷阱，例如用罗马军团对抗拿破仑士兵，以阿梅莉亚的飞行器智取卡哈蒙拉。最终，黄金碑的力量被重新引导，所有复活文物回归平静，而拉里也在此过程中领悟到责任与成长的真谛。影片结尾处，史密森尼博物馆馆长（瑞奇·热维斯饰）默许了这场奇幻事件，为后续故事埋下伏笔。整体剧情在奇幻冒险框架下，探讨了歷史传承、友谊与勇气等主题，特效场景与歷史彩蛋的融合，使影片成为一部寓教于乐的合家欢作品。